Цитотоксические эффекты веществ в гомеопатических разведениях на клеточные культуры рака молочной железы
MOSHE FRENKEL1, BAL MUKUND MISHRA2, SUBRATA SEN2, PEIYING YANG1, ALISON PAWLUS1,
LUIS VENCE3, AIMEE LEBLANC2, LORENZO COHEN1, PRATIP BANERJI4 and PRASANTA BANERJI4
1Integrative Medicine Program, 2Department of Molecular Pathology, 3Department of Melanoma
Medical Oncology, The University of Texas M.D. Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA;
4P. Banerji Homeopathic Research Foundation, Kolkata, India
Received May 28, 2009; Accepted July 23, 2009
DOI: 10.3892/ijo_00000512
В1999 г, Национальный институт рака оценил протокол лечения злокачественнх новообразований, созданный Гомеопатической Исследовательской организацией П. Банерджи ( « протокол Банерджи), в г Калькута, Индия..
«Протокол Банерджи» включил специфические гомеопатические разведения веществ натурального происхождения для лечения пациенитов с различными формами рака.
Национальный институт рака изучил результаты лечения 10 пациентов согласно « Протокол Банерджи». У 4-х из 10 пациентов с злокачественными новообразования легких и пищевода Национанальный инсутитут рака подтвердил положительные результаты (снижение прогрессирования роста злокачественных новобразований на фоне улучшения общего самочувствия и повышения качества жизни). При этом следует отметить, что пациенты кроме гомепатических средств ничего не применяли согласно « Протокола Банерджи. Национальный институт рака подтверди, что данная группа пациентов со злкачественными новобразованиями не получали ни хирургического лечения, ни лучевой терапии, ни химиотерапии. На основании полученных результатов, которые продемонстрировали положительный результат, Национальный инстутут рака принял решения о продолжении исследований эффетивности гомеопатических препаратов натурального происхождения при различных неопластических процессов.
21888 пациентов со злокачественными новобразованиями проходили курс лечения согласно « Протокола Банерджи.» на протяжении периода с 1990 до 2005 года. Среди них- 941 пациент с раком молочной железы.
В результате лечения были были получены положительные результаты: у 19% пациентов отмечено тотальное регрессирование злокачественных опухолей, в 21 % рост опухолей стабилизировался, отсутствовала тенденция к прогрессированию злокачественного роста., улучшилось общее состояние пациентов. При этом Национальный институт рака отмечает минимальную длительность стабильного периода 2 года, на протяжении которого отсутствовало прогрессирование злокачественных новообразований, при этом акцентирует внимание, что продолжительность максимального периода достигала 10 лет (5).
В 2003, Pathaker в своих исследованиях показал, что натуральное вещество в гомеопатических разведениях Ruta graveolens,, которое входит в стандарт «протокола Банерджи» лечения злокачественных новобразований головного мозга, селективно индуцирует апоптоз с последующей клеточной смертью атипических клеток мультиформной глиобластомы, промотирует при этом пролиферацию периферических лимфоцитов крови. (6).
Учитывая растущий интерес к стандартам «протокола Банерджи» среди пациентов со злокачественными новобразованиями, большинство с которых имею запущенные стадии рака, нами было решено проверить онкостатический эффект натуральных веществ в гомепатических разведениях in vitro.
В этом исследовании мы сравнивали эффекты онкостатические эффекты 4-х натуральных вществ в гомеопатических разведениях на 2 клеточных линиях рака молочной железыи на лини иммортилизированных нормальных эпителиальных клеток молочной железы, которые были получены in vitro.
Материалы и методы
Лекарственные препараты: В данном исследовании использовались лекарственные препараты в гомеопатических разведениях Sharda Boiron Laboratories Ltd India и подобные по происхождению гомеопатические субстанции Homeopathic Company (King of Prussia, PA, USA)
Каждый из экспериментов проводились паралельно 3 раза одномоментно, не менее чем с двухкратным повторением для каждого случая исследования лекарственного препарата. Лекарственные вещеста натурального происхождения были представлены в гомеопатических разведениях: Carcinosin, 30C; Conium maculatum, 3C; Phytolacca decandra, 200C, Thuja occidentalis, 30C.
Гомеопатические лекарственные препараты разводились 87% экстра-нейтральным алкоголем, представленным в качестве расстворителя.
Для установления химических компонентов в гомеопатических лекарственных препаратах применялась высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЖХ). Хроматографическая сепарация достигалась использованием С18 колонкой (5.0 мм , 250x 4.6 мм) с катриджем ( 5,0 мм 20х39 мм I. D). Мобильные фазы состояли из метанола (А ) и воды (В).
Мобильная фаза состоит из метанола ( фаза А), и воды ( фаза В) и отделение фаз достигалось посредством разделения линейного градиента 10-90% метанола в промежутке времени между инъекциями в 60 мин.
Частота потока составляла 1 мл/ мин при длине волны 254 м 220 нм. Все случаи иследований проводились в одинаковых условиях с использованием одной и той шкалы оценки с ценой деления 0,2 астрономического юнита.
Клеточные линии: 2 клеточные линии рака молочной железы MCF-7 и MDA- MB-231были получены в Американском банке клеточных культур ( Манассас ВА)
Все M CF-клетки содержали белок гена р53 дикого типа и относились к класу клеток эстоген т прогестерон чувствительного типа.
Вс клеточные линии были культивированы в среда MEM в модификации Дульбекко c 10% инактивированной при нагревании эмбриональной бычьей сывороткой Atlanta Biologicals,
Atlanta, GA), 1% L-глутамин (Invitrogen, Carlsbad, CA) и 1% стрептококковой ручки (Invitrogen).
Контрольная клеточная линия происходит из неизменных эпителиальных клеток иммортилизированных с каталитической субъединицей теломеразы и SV 40 больши- Т и малых Т- антигенов.
Контрольная клеточная линия HMLE происходящая из нормальных неизмененных эпителиальных структур
Метилтиазолидфенил-тетразолиум бромид анализ
Жизнеспособность тканей анализировалась при использовании бромида метилтиазолидфенил-тетразолиума.
Приблизительно 5000 клеток выращивали в 96 чашках 24 часа, данные клетки подвергались воздействию натуральных веществ в гомеопатичесикх разведениях через 24 часа, 48 часа, 72 часа и 96 часов. Для установления клеточной жизнеспособности, были добавлены 50 мл бромида метилтиазолидфенил-тетразолиума ( 5 мг/мл) в темной обстановке без доступа света в стерильных условиях на клеточных структурах через каждые 2 часа при 37°C. Через 2 часа бромид метилтиазолидфенил-тетразолиума был удален и после чего 100 мл диметил сульфоксида было добавлено. Чашки инкубировались в комнатной температуре 8-10 мин.
Иммуноблотинг: Экспрессия протеинов ассоциируется с регуляцией клеточного цикла и степень апоптоза установаливается при помощи вестерн-блотинга анализа контрольной и исследуемых групп клеток. Для анализа клеточного цикла использовали антитела к регуляторным протеинам клеточного цикла циклина D1 ( C D1), циклина D3( CD3), циклин-зависимой киназы 4 ( CDK4), циклин-зависимой киназы 6 (CDK6), регуляторного белка р27 ( ингибитора семейства циклинов) и фософорилированной формы Rb белка, который контролирует клеточный цикл при прохождении фазы G1 для анализа апоптического ответа, антител к апоптоз- ассоциированным протеинам поли ( поли (АДФ-рибозы) полимеразы и каспазы 7 ( клеточная сигнальная технология, Danvers, MA).
